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決定超高分辨率熒光顯微鏡成像質量的幾個因素
更新時間：2019-12-25
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超高分辨率熒光顯微鏡的成像質量主要取決于像的襯度和像的亮度, 像的襯度是由樣品中激發出的熒光與背景上觀察到的光之比決定的。背景光包括透過截止激發光的濾色片的雜散激發光, 樣品組織成分的自發熒光和光學系統的自發熒光和雜散光, 在熒光顯微術中盡全力要解決的是既獲得*的像襯度, 同時又維持像有足夠亮度, 這兩者往往是矛盾的。例如用極窄波帶濾色片激發時僅利用了極少的光能, 背景暗了但熒光亮度也弱了。在應用時, 只能兼顧, 合理的權衡以決定取舍。
超高分辨率熒光顯微鏡光學系統需要優先考慮的是:
(1) 光學系統組成的材料應選用在激發光波內無熒光材料, 不但指光學系統玻璃也包括膠合制造中的膠合劑、切片、蓋玻片和浸液以及密封劑。若有自發熒光, 不但會增加背景光, 有時還會混淆觀察熒光圖像。
(2) 光學系統的參數選擇中, 應將獲得zui大光能作為di一考慮因素。
照明系統中集光鏡應選用zui大的包容角; 采用柯勒照明并使燈絲或弧光像充滿入瞳, 以期望獲得高效率的均勻照明。
收集熒光成像的物鏡, 因為像面照度與數值孔徑NA 2 成正式, 為此作為熒光用物鏡應有較大的NA值。目*×已達015; 20×達0175; 40×達019; 油鏡40×達113。
雙目鏡筒作為熒光用時應在可見光譜段有較高的透過率, 采用鍍膜技術可大大地減少光能的損失, 它可比一般雙目鏡筒透射率提高一倍, 這對弱熒光物質觀察是必須的。
目鏡放大率不宜選大, 因為象面照度與目鏡放大率平方成反比。若其它條件相同, 當用613×目鏡時,照度定為100% , 換上1215×時, 照度約為25% , 因此常在4×～ 613×之間選用。
由此表明, 用不同物鏡和目鏡組合成同一倍率的顯微鏡時, 象面照度和曝光系數可相差數倍, 對于熒光觀察*組合是選用低倍率目鏡和NA 大的物鏡zui為合適。
(3) 作為熒光光學系統各組成部件的光譜特性也是至關重要的, 特別是紫外光要通過的部件, 如照明系統, 聚光鏡以及物鏡, 要關注紫光區的透射系數。聚光鏡要選用透紫外線的材料。照明系統中反光鏡表面鍍鋁比鍍銀好, 因為鋁在UV 和V 區反射率在90% 以上, 而銀僅達70%。加拿大膠吸收紫外線, 在紫外區通過處不宜用作膠合劑。
